自体间充质细胞包埋Tissucol Duo？防止解剖肺切除术后空气泄漏：一项长期随访的前瞻性I／II期临床试验结果

　　长时间漏气(PAL)是肺切除术后最常见的并发症。目前已有几种预防高危患者发生PAL的措施，然而，间充质干细胞(MSCs)应用于实质缝合线以防止术后空气泄漏的潜在作用尚未得到充分解决。

　　目的探讨自体间充质干细胞包埋Tissucol Duo?作为预防高危患者肺切除术后长时间漏气的预防性替代方案的可行性、安全性及潜在临床疗效。

　　I/II期单臂前瞻性临床试验。

　　6例PAL高危患者接受择期肺切除术。自体骨髓来源的间充质干细胞在我们的良好生产规范(GMP)工厂进行扩增，并在肺切除手术期间植入(嵌入Tissucol Duo?载体)实质缝合线。术后早期对患者进行监测，评估可能出现的并发症或不良反应。此外，对所有患者进行了5年的临床随访。

　　纳入患者的中位年龄为66岁(55-70岁)，男女比例为5/1。5例自体间充质干细胞扩增，1例间充质干细胞扩增不足。未见与细胞植入相关的不良反应。关于疗效，中位漏气持续时间为0天(范围:0 - 2天)。PAL的发生率为零。放射学上，只有一个病人在出院时的胸片上表现为气胸。随访期间未发现与该手术相关的不良反应。

　　自体间充质干细胞用于PAL高危患者的预防是可行、安全且潜在有效的。

　　试验注册号:EudraCT: 2013-000535-27。Clinicaltrials.gov识别码:NCT02045745。

　　术后漏气的定义是在任何类型的胸部手术后，空气从肺实质渗漏到胸膜间隙。尽管在大约一半的肺切除术患者中报告了任何形式的漏气，但大多数漏气在几小时或几天内消失，到术后第5天(不包括肺减容手术)，漏气率降至5 - 20%[1,2]。

　　欧洲胸外科学会(ESTS)数据库和胸外科学会(STS)数据库中报告并收集了持续时间超过5天的空气泄漏，这5天的持续时间通常被认为是胸外科术后长时间空气泄漏(PAL)定义的阈值。est数据库银册最新报道的数据显示，肺叶切除术后PAL的发生率为9.4%，肺减容手术后PAL的发生率为22.5%[3]。在西班牙，西班牙视频辅助胸外科小组(GEVATS)最近发表的一项全国前瞻性多中心登记研究结果显示，解剖性肺切除术后PAL的发生率为11.86%[4]。

　　由于患者住院时间(LOS)的增加以及住院时间和各种必要干预措施的成本增加，PALs成为医疗保健系统的负担[5]。在这方面，重度PAL的发生率(定义为需要干预才能愈合的患者)在肺切除术后约为5%[6]。此外，其发生与较高的胸膜感染风险[7]、再入院[8]和患者生活质量受损[5]有关。

　　一些研究已经确定了PAL的危险因素[9,10,11,12,13]，包括年龄较大，体重指数(BMI)较低，胸膜粘连的存在，外科医生的经验，第一秒用力呼气量(FEV1)较低，一氧化碳扩散能力(DLCO)较低，类固醇使用和术后早期空气泄漏流量(mL/min)较高(通过数字胸腔引流系统测量)[12,13,14]。此外，一些基于术前危险因素的PAL评分已经被开发出来，目的是识别高危患者[15,16,17,18]，这些患者可以从早期干预中获益。

　　由于现有的证据表明PAL的有害后果和危险因素的识别，已经描述了一些措施来防止肺手术后的术后空气泄漏。这些措施包括手术技术，如“胸膜帐篷”[19]或“无裂隙技术”[20]，以及使用支持进行实质缝合[21]或使用组织密封剂[22,23,24]。关于组织密封胶，存在一定的争议。一方面，有证据支持在先前引用的临床试验中使用它们，但一项系统综述[25]建议，由于缺乏确凿的有效性证据和高成本，不应常规使用它们。另一方面，近年来，由于间充质干细胞能够分化成各种细胞系，并作为抗炎和免疫调节剂，使这种细胞类型成为一种有前途的治疗工具，在再生医学和组织工程中具有潜在的应用前景，人们对细胞治疗的兴趣日益浓厚[26,27]。骨髓间充质干细胞可以从骨髓、腹部脂肪或滑膜等多种来源获得，在临床上已被评估用于治疗多种疾病[28,29]，包括肺部疾病[30]。骨髓间充质干细胞可以通过生物传递系统，如纤维蛋白胶，作为一种临时基质，有利于细胞-基质相互作用，并允许骨髓间充质干细胞的局部和旁分泌功能。此外，使用纤维蛋白胶携带MSCs的细胞治疗策略在再生神经损伤[31]和治疗骨或软骨组织病变[32]方面显示出良好的效果，然而，尚无研究证明其在再生肺部病变方面的潜力。

　　在动物模型上，有关于人脂肪干细胞对受损内脏胸膜间皮细胞再生作用的临床前数据报道[33]。然而，目前还没有前瞻性临床试验评估MSCs在良好生产规范(GMP)设施中的作用，并根据国际细胞治疗学会(ISCT)标准发布，在预防人类肺切除术后空气泄漏方面。因此，与西班牙药品管理局(AEMPS)达成协议，设计了一项具有最大样本量的小型前瞻性I/II期试验，以在人体中测试这种先进治疗医疗产品(ATMP)。这也是由MSCs与纤维蛋白密封剂Tissucol Duo?(Baxter AG, Vienna, Austria)相互作用的体外表征及其在小鼠模型中的临床前评估开始的转化研究线的最后一部分[34]。该试验得到了国家卫生系统用于非商业临床试验开发的公共资助(见致谢)。

　　本研究的目的是评估将自体骨髓间充质干细胞包埋在Tissucol Duo?载体中，应用于解剖性肺切除术中PAL风险增加的患者的实质缝合线的可行性和安全性。

　　我们进行了一项开放、单中心、前瞻性、单臂I/II期临床试验(EC代码:CSM/FAP/ 2012-EudraCT: 2013-000535-27)。该试验由萨拉曼卡大学医院伦理委员会和AEMPS(机构审查委员会协议号:13/1005)审查并批准。所有患者均签署了经批准的知情同意书，所有程序均符合《赫尔辛基宣言》的原则。

　　此外，在临床试验之外，采用相同的纳入和排除标准(见下一节)，对另外两名在慈悲使用下肺切除术后接受MSCs治疗的患者的围手术期和长期结果进行了评估。

　　术前，所有诊断为肺癌或可疑肺结节的患者均接受了广泛的检查，包括体格检查、血液学和生化检查、心电图、胸部和腹部计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)和支气管镜检查。只有根据临床表现或异常实验室结果认为有必要时才进行进一步调查。既往有心血管病史或心电图有任何可疑变化的患者由心脏病专家进行评估。所有患者均行肺功能检查。在本研究中，根据患者的年龄、性别和身高，我们只回顾了第一秒用力呼气量的百分之一值(FEV1%)。

　　术前根据Brunelli[15]与我们团队在2010年合作提出的PAL评分进行PAL风险评估。评分的危险因素包括:年龄> 65岁(1分)、BMI < 25.5 kg/m2(2分)、FEV1% < 80%(1.5分)、胸膜粘连(1分)。根据获得的评分将PAL风险分为A(0分)、B(1分)、C(1.5-3分)、D(> 3分)四个等级。

　　纳入标准为同意能力、年龄在18 - 70岁之间、计划行解剖性肺切除术(不包括全肺切除术)、PAL评分C级或D级。

　　排除标准包括不能耐受手术干预、手术的临床或麻醉禁忌症(美国麻醉医师协会(ASA)评分为IV或V)、存在严重的非控制全身性疾病、妊娠、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)或梅毒血清学阳性以及没有或撤销知情同意(表1)。

　　表1纳入和排除标准

　　研究人群还包括一个在同情使用下肺切除术后接受msc治疗的患者队列，在临床试验之外，但具有相同的标准。该队列包括一个因肺气肿而需要肺减容手术的PAL高危病例。他们都签署了一份明确的知情同意书。

　　由于该研究设计为I/II期试验，估计样本量(安全磨合队列)为6至12名受试者。

　　如前所述[35]，细胞生产在萨拉曼卡大学医院的GMP细胞生产部门进行。ATMP是根据AEMPS批准的临床试验研究药品档案(IMPD)代码PEI-13-072在我们的GMP工厂生产的。简单地说，在手术室无菌环境下，在镇静状态下从每位患者的髂嵴取50-100 mL BM，并转移到GMP设施。然后，密度梯度离心后获得单个核细胞，在含有5%血小板裂解液的α - mem培养瓶中接种，分离MSCs，体外培养，直到满足以下释放标准:> 0.5 × 106 MSCs/kg受体体重，> 80%存活率和表型和分化能力的ISCT定义标准[36]。

　　细胞给药与胸外科小组协调。包含Tissucol Duo?的两种深度冷冻溶液(sealer蛋白溶液和凝血酶溶液)在使用前24小时解冻。每种溶液在一个双腔注射器的单独预加载腔中呈现。收集间充质干细胞，用生理盐水重悬，并在尽可能短的时间内适当标记送至手术室。解冻并将Tissucol Duo?加热至37°C后，在给药前立即将细胞重悬于凝血酶注射器中。将制备的两种溶液(sealer蛋白溶液和凝血酶溶液与MSCs)混合使用。

　　在研究期间，所有病例的围手术期处理是统一的。术前抗生素方案包括单剂量头孢呋辛1500mg，如果手术继续，6小时后重复。麻醉程序由一名资深心胸麻醉师指示和执行或监督，所有病例均由同一组资深胸外科医生进行手术，通过视频辅助胸外科手术、前外侧或保留肌肉的后外侧开胸入路。

　　在解剖切除血管和支气管结构后，所有病例均进行机械(订书机)肺实质缝合，并用袋子取出标本。然后在15-20 cm H2O的标准气道压力下通过水浸泡试验评估空气泄漏。根据马基亚里尼量表(Macchiarini scale)验证0级(无明显泄漏)或1级(轻度，可计数气泡)空气泄漏后，将最终产品(嵌入Tissucol Duo?中的自体间充质干细胞)应用于实质缝合线[37]。本品在实质缝合线上局部给药，在开胸手术中直接用双腔注射器给药，在视频胸腔镜手术中使用喷雾系统给药。为了避免形成多余的肉芽组织，并确保固化的混合溶液逐渐被吸收，只使用薄层产品。每例患者接受1-2 × 106细胞/cm2的实质缝合剂量。这个最终产品是唯一用于防止空气泄漏的物质。

　　在所有患者中，在手术结束时将24F或28F胸管留在心尖，并连接到Atrium?Ocean?Water Seal胸腔引流装置。该装置在水封上有一个刻度，从0到5分级，以直观地量化空气泄漏。

　　在手术室拔管，患者在恢复室平均6小时后转至心胸病房。

　　术后镇痛是基于术前插入硬膜外或椎旁导管，在前2或3天持续输注布比卡因和芬太尼，并根据需要静脉镇痛。随后给予口服扑热息痛和非类固醇抗炎药。所有病例的护理也是同质的，并包括激励肺活量测定。所有的患者都被纳入我们特定的术前和术后胸部物理治疗方案，详见其他文献[38]。

　　术后24小时，患者在心胸外科病房和胸部物理治疗后，由两名观察员评估胸管漏气情况。患者在1分钟的时间内进行深用力呼气。在每次呼气时，我们记录在胸排水孔的分级水封中观察到的气流。术后每天重复这种操作和评估漏气情况，直到取出胸管。

　　术后每日记录患者心肺并发症的发生情况及胸片上气胸的出现情况。

　　术后随访持续至至少24个月，包括5次随访(1、3、6、12和24个月)，记录临床结果(并发症症状或体征)和影像学评估。影像学检查包括在随访1、3、12和24个月时进行胸部x线检查以排除气胸的存在，并在随访6个月时进行CT检查以发现潜在的病理发现。

　　虽然该试验的初始随访为24个月，但我们对所有患者进行了额外的5年随访，以评估长期安全性和有效性。

　　摘要。

　　背景

　　方法

　　结果

　　讨论

　　结论

　　数据和材料的可用性

　　缩写

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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　　2014 - 2016年在我院筛选6例纳入试验的患者，最终全部纳入研究，2018年有2例肺切除术后应用MSCs作为体恤使用。

　　如前所述，最终人群由单个实验治疗组6例患者(5男1女)组成，中位年龄为66岁(55-70岁)。平均FEV1%为69.4%(范围:58.6-79.9%)。中位BMI为22.97 kg/m2(范围:18.75-25.45 kg/m2)。4例术前怀疑胸膜粘连。PAL评分为C级(1.5 ~ 3分)2例，D级(> 3分)4例。根据ASA评分，这些患者的麻醉风险为1例为ASA II, 5例为ASA III。主要诊断是非小细胞肺癌(NSCLC)。

　　骨髓间充质干细胞用于体情治疗2例肺气肿男性患者，年龄分别为64岁和73岁，BMI和FEV1%均较低。这两例患者的PAL评分均为d级。这两例患者的手术包括肺减容手术治疗大疱性肺气肿。

　　表2总结了患者的详细信息。

　　表2患者特征

　　临床试验中包括的5例MSCs扩增成功，其中2例MSCs被认为是同情使用。在一个病例中，尽管在两次不同的尝试中从患者的髂骨收获了足够的骨髓基质，但MSCs扩增不足。

　　7例肺切除术后局部应用间充质干细胞，术中未发现并发症。所应用的细胞产物的主要特性总结在表3中。

　　表3细胞制备的主要特性和应用的细胞产物

　　在纳入试验的患者中，PAL发生率为零，中位漏气持续时间为0天(范围0 - 2天)。出院时仅有1例胸片表现为气胸。接受骨髓间充质干细胞治疗的患者均未出现任何术后心肺并发症。住院时间中位数为6天(范围:4-6天)。出院后30天内无一例因手术并发症再次入院，30天死亡率为零。

　　对于使用MSCs作为同情使用的患者，一名患者发生PAL，持续32天，并在没有后续手术干预的情况下消退。然而，两例患者均未发现其他并发症。

　　主要术后结果见表4。

　　表4主要术后结局

　　随访期间，所有患者均未出现并发症的体征或症状。1例患者化疗后出现与辅助治疗相关的白细胞减少，经药物方案修改后有所改善。在随访1、3、6、12或24个月期间，我们未发现任何患者的x线或CT病理表现为气胸。

　　1例患者在完成最初随访(2年)前因疾病进展(脑转移)死亡，这是在手术后19个月诊断出来的。因细胞扩增不足而未接受骨髓间充质干细胞的患者在术后14个月死于继发于肺炎的呼吸衰竭。其余4例患者随访6年以上，常规临床及影像学检查均未见病理结果。

　　对于接受骨髓间质干细胞治疗的患者，在超过50个月的随访后，他们仍然存活，没有发现与治疗相关的并发症或病理发现。

　　主要的长期随访结果总结于表5。

　　表5随访

　　在最初的2年随访和5年随访中均未发现与手术相关的主要并发症或不良副作用(包括异位骨化、感染或可归因于MSCs给药的肿瘤)。

　　在过去的十年中，细胞疗法和组织工程在许多没有有效治疗方案的疾病条件下获得了极大的兴趣，许多研究已经探索了细胞疗法治疗几种实体的潜力。在肺部疾病领域，MSCs因其免疫调节能力、组织再生、细菌清除、促血管生成和抗纤维化等特性，为各种急慢性肺部疾病的细胞治疗提供了一种新颖而有前景的选择[39]。

　　自1970年Friedenstein等人[40]首次分离MSCs以来，MSCs已成为再生医学临床开发计划中最常见的细胞类型。在过去的几十年里，许多临床前研究表明，MSCs用于治疗多种肺部疾病，包括慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征和特发性纤维化后，疾病相关参数有所改善[41]。最近，Lanzoni等人进行的一项I/II期双盲随机临床试验[42]证明了脐带间质干细胞治疗冠状病毒病(COVID-19)急性呼吸窘迫综合征的安全性和潜在益处。

　　关于MSCs在损伤肺中的应用，2005年Rojas等[43]将骨髓来源的间充质干细胞移植到博莱霉素损伤小鼠肺中，发现骨髓干细胞在修复过程中起重要作用，间充质干细胞的移植对损伤有保护作用。移植的间充质干细胞可定位于损伤肺，获得肺实质细胞特征。同样，在我们之前提到的小鼠初步研究中[34]，我们发现，在肺实质损伤后，使用纤维蛋白密封剂系统递送的人脑源性间充质干细胞能够在愈合过程中融入受损的实质，表达不同的形态特征。此外，Shigemura等[44,45]报道，在大鼠肺气肿肺减容手术后，将脂肪组织来源的基质细胞(ASCs)自体移植到残肺模型中，通过选择性地诱导受损肺组织中肝细胞生长因子(HGF)的表达，可增强肺泡和血管再生。Kim等人[33]在兔模型中描述了人ASCs移植到受损内脏胸膜的形态学影响，他们得出的结论是ASCs可以促进间皮细胞的再生，有助于治疗和预防肺泡漏气。此外，使用纤维蛋白密封胶携带的间充质干细胞的细胞治疗策略在再生医学中显示出有希望的结果[31,32]。纤维蛋白密封剂提供了一种临时结构，有利于血管生成、细胞外基质沉积和细胞-基质相互作用，并维持MSCs的局部和旁分泌功能，从而导致组织再生。

　　然而，到目前为止，还没有使用嵌入纤维蛋白密封剂的间充质干细胞来预防人类肺部手术后PAL的I/II期临床试验。在本研究中，我们根据Brunelli评分纳入了术后PAL的高危患者，但根据其病理诊断和术前合并症，这些患者也是高危患者。因此，试验中有5/6的患者被诊断为恶性肿瘤，与良性病理相比，PAL发病率增加(OR: 1.45)，而在同情使用下应用MSCs的2例患者被诊断为肺气肿，这也与PAL风险增加显著相关(OR: 2.35)[46]。

　　我们研究的主要优势包括，首先，它使用GMP工厂生产的MSCs，并根据ISCT标准发布，并满足相应监管机构(AEMPS)的要求，在人体中测试这种ATM。其次，我们的试验是一项前瞻性研究，将自体骨髓间充质干细胞与市售的聚合物密封剂(Tissucol Duo?)混合，并应用于实质缝合线，从而使最终产品均匀，制备和给药技术易于重复。第三，一项随机对照试验的系统综述和荟萃分析证明了聚合物密封剂在防止肺泡空气泄漏和缩短空气泄漏持续时间方面的安全性和有效性[47]。最后，在一些病例中，最后的随访延长了7年以上，在安全性和耐受性方面的长期结果非常好。

　　我们的研究有一些局限性。首先，由于该研究设计为I/II期试验，因此纳入的患者数量较少，尽管我们认为这足以证明该手术的安全性和可行性，因为在随访期间没有报告继发性不良反应。其次，关于该手术疗效的结论必须谨慎考虑，因为尚未将MSCs嵌入Tissucol Duo?中预防术后PAL的治疗效果与其他密封剂或替代治疗方法进行比较。然而，结果是有希望的，并可能鼓励设计更大的II/III期试验。此外，不同的细胞剂量尚未经过测试，可能会对短期结果和治疗效果产生影响。因此，应该进行进一步的前瞻性试验来评估这方面。

　　我们已经展示了第一个概念验证，确认了该程序的可行性和安全性，并提供了长时间的随访(三名患者超过7年)，这进一步保证了I-II期试验的主要目标的实现，其中没有次要效应是最重要的发现。

　　同样值得注意的是，在接受骨髓间充质干细胞的患者中，PAL的发生率为零，只有一名患者在出院时出现气胸。这些结果表明MSCs应用于实质缝合线预防高危患者PAL的有效性。此外，在随访期间，我们没有发现任何临床体征或并发症的症状，或与治疗相关的病理放射学发现。

　　总之，目前的临床试验结果表明，自体MSCs细胞治疗预防高危患者PAL是安全可行的。虽然纳入试验的病例数量较少，但随访时间超过5年，未发现与细胞给药相关的不良副作用。

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